细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤癌细胞和细菌的机制

研究背景

众所周知，细胞毒性T淋巴细胞（CTL）能够凭借多种生物学功能去杀死感染的细胞和癌细胞。CTL找到靶细胞，跟靶细胞接触形成免疫突触（IS），从分泌溶酶体（SLs）里释放穿孔素（Prf1）和颗粒酶。穿孔素是一种刺穿靶细胞外膜的蛋白质，能在靶细胞上打孔，介导诸如颗粒酶B(Gzmb)的颗粒酶从打好的孔进入靶细胞，启动多种途径导致靶细胞死亡。去年还有研究发现，在没有穿孔素的情况下，CTL单依靠自身的机械运动也能完成打孔，杀伤靶细胞。不过CTL中，穿孔素、颗粒酶等活性物质是如何释放的？杀伤性T细胞是仅仅释放出颗粒酶和穿孔素，还是依靠特殊结构将杀伤性分子转运至靶细胞，目前尚不清楚。

细胞毒性T细胞

癌细胞

结果

为此，作者用红色荧光标记了细胞毒性T淋巴细胞中的颗粒酶，用绿色荧光标记了分泌溶酶体里的糖蛋白WGA。发现被双标记的细胞毒性T淋巴细胞与带有pp65-HLA-A2复合物的靶细胞接触后，靶细胞上出现了强烈的双阳性斑点，而与无pp65-HLA-A2复合物的靶细胞接触则没有该现象（图1A）。作者称之为超分子攻击粒子（SMAP），并对其进行进一步分析。

为了进一步对SMAP进行研究，作者将CTL置于一层类似于包围细胞膜的双层脂质（SLB）上，模拟靶细胞，其中还添加了ICAM-I和CD3ε抗体，帮助CTL粘附并激活CTL。全内反射荧光显微镜检查（TIRFM）表明，在CTL粘附到人工脂双层上后，CTL中的分泌溶酶体很快向免疫突触处聚集。1分钟内，在免疫突触中即出现颗粒酶阳性斑点（图1B）。与SMAP中颗粒酶的释放一致，颗粒酶阳性信号在免疫突触中持续存在20分钟，然后分散，表明CTL在吸附后开始释放SMAP，SMAP结合到了SLB上。作者为确定在移除CTL之后，SMAP是否仍附着在SLB上。在20分钟内在免疫突触中检测到穿孔素和颗粒酶免疫反应性，并且在去除CTL后仍以离散颗粒的形式保留在SLB上（图1C-D）。抗体分析表明，SMAP稳定，而且在分泌后数小时内穿孔素和颗粒酶都没有丢失。在细胞毒性试验中，作者证实了SMAP缺乏LDH活性，且能杀死靶细胞（图1E）。因此，SMAP从CTL释放后是稳定的，可以自主杀死靶细胞。

通过对人工脂双层上捕获的SMAP进行质谱分析，发现SMAP中始终存在超过285种蛋白质（图2A-B），于所有实验中检测出多种颗粒酶，并在多个实验中检测到穿孔素；通过SDS-PAGE和免疫印迹进一步证实了SMAP中穿孔素和颗粒酶的存在。还确定了许多与细胞信号传导有关的蛋白质，但未检测CD45、CD107a等膜蛋白。其中，血小板反应蛋白1（TSP-1）是一种细胞外基质糖蛋白，基于其标志性的Ca2 +结合特点，与CTL的杀伤过程需要钙离子相吻合，引起了作者的关注。CTL分泌SMAP的实时图像显示TSP-1和穿孔素一起释放。此外，TIRFM结果显示，SMAP中TSP-1与颗粒酶和穿孔素共定位（图2C），且在CTL中TSP-1与颗粒酶和穿孔素也共定位。该结果表明，很可能在CTL的分泌溶酶体中，穿孔素、颗粒酶和TSP-1等分子就已经组装成了SMAP等待释放。进一步研究也显示，在CTL中敲除掉60%的TSP-1后，CTL杀伤靶细胞的能力下降了30%，而几乎完全敲除另一种类似富集的蛋白质galectin-1后，对CTL杀伤靶细胞的能力没有影响（图2D-E）。这些结果表明，TSP-1的C末端是SMAP的一个组成部分，在CTL介导的杀伤作用中很重要。

接下来，作者通过直接随机光学重建显微镜（dSTORM）研究了SMAP的分子在20nm分辨率下的组成。平均在每个免疫突触内检测到27±12个SMAP，Alexa 647-WGA标记（WGA染色）在二维投影中显示为密环，表明球形壳的平均直径为120±43 nm（图3A）。许多超分子组装体使用磷脂双层作为支架，因此作者猜想SMAP能否被亲脂性膜染料DiD染色，该染料可明亮地染色细胞外囊泡或脂蛋白。结果显示，DiD未染色SMAP，这与质谱检测到SMAP中膜蛋白稀少相符。因此，SMAP不具有磷脂膜，WGA染色模式最符合糖蛋白外壳。通过多色dSTORM研究TSP-1在SMAP中的位置。令人惊讶的是，TSP-1与WGA共定位，并类似地突出显示了SMAP的形状（图3B）。因此，证明了来自CTL的SMAP具有含TSP-1的糖蛋白外壳。作者使用低温软X射线断层扫描（CSXT）进一步研究SMAP的结构。结果显示，释放的SMAP平均直径为111±36 nm。CSXT中观察到的含碳致密外壳与dSTORM观察到的TSP-1 / WGA壳一致。CSXT分析进一步强调了CTL细胞内多核颗粒似乎与SMAP紧密堆积，在其中溶解了较低密度的核。这些多核颗粒与活化网格附近的CTL表面相关，表明SMAP储存在多核颗粒中（图3C-D）。

单个SMAP的dSTORM观测显示，TSP-1 / WGA外壳将部分重叠的穿孔素和颗粒酶区域包裹（图4A-B）。作者还在SMAP的核心中检测到Srgn。含有穿孔素和颗粒酶的SMAP比没有细胞毒性的WGA +颗粒更大，且内容物更丰富（图4C-D）。基于上述结果得出SMAP是一种具有自发细胞毒性的粒子，直径约120 nm，具有包含穿孔素、颗粒酶和Srgn的核心和含TSP-1的致密外壳，以及令人惊讶的抗体可及性。

总结与讨论

该研究发现，CTL攻击“外敌”时，会利用充满致命化学物质的蛋白质“炸弹”杀伤靶细胞。CTL的细胞毒性物质——穿孔素和颗粒酶，并非直接被释放到靶细胞周围，而是互相结合，组装成一个具有糖蛋白外壳的超分子攻击粒子（SMAP），释放到靶细胞细胞膜上。这个SMAP十分稳定，直径约120 nm，具有包含穿孔素、颗粒酶和Srgn的核心和自发的细胞杀伤活性。其糖蛋白外壳里的TSP-1，对它的细胞杀伤活性十分关键。此外，TSP-1分子中还包含CD47结合位点。CD47是一个“别吃我”信号，作者推测，CD47被TSP-1结合屏蔽后，可以引来巨噬细胞等等髓系免疫细胞，保证没被SMAP杀死的靶细胞可以通过吞噬作用而被清除。而SMAP还含有CCL5、IFN-γ等免疫调节分子，其复杂成分使其可能在信号传导和免疫调节中还具有更多的作用。

该研究揭示了CTL杀伤癌细胞和细菌的细节和机制，进一步加深了我们对CTL如何清除危险细胞的了解。该研究中利用的各种成像技术，如全内反射荧光显微镜（TIRFM）和低温软X射线断层扫描（CSXT）分析，可以于其他实验中加以采用。含有许多细胞毒性蛋白复合物的SMAP轰击靶细胞后会引起细胞哪些反应；SMAP是否能在肿瘤免疫中发挥作用；以及在免疫抑制的微环境中，SMAP中的内容物是否发生改变等也值得我们进一步探索。

本文于2020年05月22日在线发表于Science，Š. Bálint作为第一作者，M. L. Dustin为通讯作者，牛津大学为第一通讯单位。

原文链接：https://doi.org/10.1126/science.aay9207

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